Produksi Embrio In Vitro

1. Persiapan

a. Media yang harus disiapkan antara lain media transportasi dan penyimpanan ovari dari RPH, media untuk aspirasi oosit, maturasi oosit, mencuci semen (sperma), mengencerkan semen, fertilisasi dan untuk culture.

b. Peralatan yang harus disiapkan : gunting, pinset, kapas alkohol, tissue, needle 18G, petri dish 100x100 mm dan 35x10 mm, syringe 5 ml, termos, sarung tangan karet, inkubator CO2 , centrifuge, water bath, timbangan elektrik dan lain lain.

2. Pelaksanaan

A. Koleksi Ovarium

a. Pengumpulan ovari di RPH dari sapi betina yang baru dipotong langsung disimpan dalam media transportasi (Laktat Ringer (LR) + antibiotik/ PBS + antibiotik) pada suhu 38C.

b. Lama waktu transportasi ovarium dari RPH sampai ke laboratorium sekitar 6 sampai 8 jam. Selama dalam perjalanan diharapkan suhu stabil 38oC.

B. Aspirasi Oosit

a. Ovarium dibersihkan dan dicuci dengan media LR dan antibiotik kemudian direndam dalam D-PBS (media aspirasi) dan tetap berada pada suhu 38C.

b. Aspirasi oosit dari ovarium dengan menggunakan syringe dan needle 18G yang telah diisi D-PBS, hasil aspirasi yang diperoleh dikumpulkan dalam petridish 100x100mm.

C. Invitro Maturasi Oosit/IVM

a. Oosit dicuci (dari petridish 100x100mm) dan dievaluasi berdasarkan kualitasnya (A (COC/Oosit tertutup sel kumulus) , B (Oosit tertutup kumulus tipis), C (tidak tertutup sel kumulus), dan D sel kumulus yang menutupi terlalu tebal)).

b. Oosit yang dikoleksi dikumpulkan pada petridish 10x35mm dalam media D-PBS.

c. Oosit dengan kualitas A dan B dimasukkan dalam media maturasi yang telah ditutup dengan mineral oil lalu dibilas untuk menghilangkan sisa media D-PBS.

d. Setelah dibilas 1 - 2x dimasukkan pada drop media maturasi (TCM-199) yang di tutup mineral oil, lalu disimpan dalam CO2 inkubator pada suhu temperatur 38,5C dan kandungan CO2 2 - 5% selama 18 - 22 jam.

D. Invitro Fertilisasi/IVF

a. Menyiapkan media fertilisasi (BO/Brackett and Oliphant solution) yang dibagi menjadi tiga bagian yaitu semen washing solution/media pencuci semen (BO, Na Caffeine Benzoate dan Heparin), Oosit washing solution (BO, BSA/Bovine Serum Albumin), Semen Dilution Solution (BO, BSA)

b. Kapasitasi sperma : thawing semen pada suhu + 38C lalu dimasukkan dalam centrifuge tube, dicuci 2 kali dengan media pencuci semen dan di centrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 1800 rpm. Sperma diencerkan hingga mencapai konsentrasi 12,5 x 10 6. Proses kapasitasi ini tidak boleh lebih dari 30 menit, kemudian dibuat drop semen yang telah disesuaikan konsentrasinya dan di cover dengan mineral oil.

c. Oosit yang telah dimaturasi dicuci dengan media pencuci oosit.

d. Fertilisasi : oosit yang telah dimaturasi dimasukkan ke dalam drop semen, lalu dimasukkan ke dalam CO2 inkubator, proses fertilisasi antara 5 18 jam.

E. Invitro Culture/IVC

a. Oosit yang telah difertilisasi selanjutnya dicuci dengan media culture (CR1aa/TCM 199), lalu dimasukkan ke dalam drop culture (media culture, untuk satu oosit dibutuhkan media 5 l) dan dimasukkan di dalam inkubator CO2.

b. Hari ke-2 pengamatan perkembangan embrio (catatan : bila menggunakan Media TCM-199, media diganti setiap 2 hari).

c. Pengamatan perkembangan Blastosist pada hari ke 6 8 dengan asumsi embrio dalam fase blastosit.

Dibaca : 4.892 kali